基因工程疫苗精品(七篇)

序論：寫作是一種深度的自我表達(dá)。它要求我們深入探索自己的思想和情感，挖掘那些隱藏在內(nèi)心深處的真相，好投稿為您帶來了七篇基因工程疫苗范文，愿它們成為您寫作過程中的靈感催化劑，助力您的創(chuàng)作。

篇(1)

關(guān)鍵詞：植物疫苗；基因工程；表達(dá)系統(tǒng)；安全性

1 植物疫苗的免疫原理

植物疫苗可誘導(dǎo)粘膜免疫反應(yīng)，小腸淋巴組織的粘膜上有一種特殊的細(xì)胞叫做膜細(xì)胞（M 細(xì)胞）。粘膜免疫應(yīng)答就是由M 細(xì)胞識(shí)別抗原開始的。M細(xì)胞識(shí)別抗原并將其傳遞給巨噬細(xì)胞，巨噬細(xì)胞和其它抗原呈遞細(xì)胞，再將抗原展示給輔T細(xì)胞，輔T細(xì)胞識(shí)別外源蛋白質(zhì)片段后就會(huì)刺激B細(xì)胞制造和釋放能中和抗原的抗體，當(dāng)疾病因子出現(xiàn)時(shí)，記憶輔T細(xì)胞刺激胞毒T 細(xì)胞攻擊受感染的細(xì)胞，同時(shí)它迅速刺激記憶B 細(xì)胞分泌中和抗體消滅入侵的病原體?？偟膩碚f，轉(zhuǎn)基因植物疫苗可以誘導(dǎo)相應(yīng)的血清型的IgA 和IgG 反應(yīng)。

2 植物疫苗的特點(diǎn)

2.1 安全性高

植物是人類食物來源之一，除個(gè)別人群對(duì)某些特定的植物過敏外，其安全性高。用動(dòng)物細(xì)胞生產(chǎn)疫苗，可能有動(dòng)物病毒的污染，對(duì)人類存在潛在危害。而植物病毒不會(huì)感染人類，比較安全，同時(shí)也可避免微生物生產(chǎn)疫苗帶來的有害產(chǎn)物。

2.2 成本低

植物種植系統(tǒng)簡(jiǎn)單易行，植物細(xì)胞培養(yǎng)條件簡(jiǎn)單，便于進(jìn)行遺傳操作，可通過大面積栽培獲得廉價(jià)的疫苗，且不需要技術(shù)、設(shè)備和種植條件等巨大投資。農(nóng)作物可以當(dāng)?shù)厣a(chǎn)，還易于儲(chǔ)藏和運(yùn)輸，而且經(jīng)過長(zhǎng)期種植，植物栽培、收獲、貯藏、加工程序已經(jīng)形成工業(yè)化。與植物生物反應(yīng)器相比，原核生物反應(yīng)器與動(dòng)物生物反應(yīng)器生產(chǎn)時(shí)需要昂貴的技術(shù)設(shè)備、大量的人力物力。

2.3 植物具有完整的真核表達(dá)系統(tǒng)

具有與動(dòng)物相同的真核加工修飾系統(tǒng)?？梢詫?duì)重組蛋白進(jìn)行糖基化、磷酸化、酰胺化、亞基正確裝配等。微生物系統(tǒng)不能對(duì)真核生物蛋白進(jìn)行正確的翻譯后加工。

2.4 轉(zhuǎn)基因植物中的外源基因可重組

通過植物雜交的方法進(jìn)行基因重組，進(jìn)而在植物體內(nèi)積累多種病原體的抗原基因，生產(chǎn)出方便高效的多聯(lián)疫苗。

3 植物基因工程疫苗外源基因的表達(dá)系統(tǒng)

3.1 瞬時(shí)表達(dá)系統(tǒng)

主要采用植物病毒作為載體，而外源基因插入到病毒基因組中，通過病毒感染植株，從而將外源基因?qū)胫参锛?xì)胞內(nèi)，采用這種轉(zhuǎn)化方式，外源基因并不整合至植物基因組中，只是利用寄主細(xì)胞在細(xì)胞質(zhì)中進(jìn)行復(fù)制，以高拷貝的形式游離于植物中，并進(jìn)行高效的表達(dá)，因此可在短時(shí)間內(nèi)在植物細(xì)胞內(nèi)積累大量的外源蛋白。采用農(nóng)桿菌介導(dǎo)的轉(zhuǎn)化，外源基因蛋白的產(chǎn)量一般要低于細(xì)胞內(nèi)可溶性蛋白總量的1%；而采用這種瞬時(shí)表達(dá)系統(tǒng),外源基因蛋白總量會(huì)遠(yuǎn)大于1%。

3.2 穩(wěn)定整合系統(tǒng)

3.2.1 土壤農(nóng)桿菌介導(dǎo)的遺傳轉(zhuǎn)化。目前根癌農(nóng)桿菌主要用于雙子葉植物的遺傳轉(zhuǎn)化，其轉(zhuǎn)化植物的機(jī)制已從分子水平上基本得到解釋。而發(fā)根農(nóng)桿菌，由于對(duì)Ri 質(zhì)粒了解得還不充分，所以對(duì)這種轉(zhuǎn)化系統(tǒng)的研究主要集中在以生產(chǎn)次生代謝產(chǎn)物為目的的根組織培養(yǎng)和根的發(fā)育。采用農(nóng)桿菌介導(dǎo)的植物轉(zhuǎn)化最常采用共培養(yǎng)法，即使用農(nóng)桿菌菌液與葉盤、愈傷組織、懸浮培養(yǎng)細(xì)胞、莖段、下胚軸段、子葉切片等部分進(jìn)行共培養(yǎng)，從而達(dá)到轉(zhuǎn)化的目的。

3.2.2 外源DNA 直接導(dǎo)入法。主要包括基因槍法、電激發(fā)、PEG誘導(dǎo)法、激光穿孔法、脂質(zhì)體法、超聲波法，其中最常用的是基因槍法。它是將帶有外源基因的質(zhì)粒用亞精胺包裹為直徑1μm 左右的金彈或鎢彈，再用高壓氦氣、火藥爆炸力、高壓放電氣體作為動(dòng)力加速子彈，使它們穿過植物細(xì)胞壁和細(xì)胞膜，將外源基因帶入具有再生能力的植物組織，這樣可以在很大程度上縮短再生的時(shí)間，從而避免體細(xì)胞變異的發(fā)生。

4 以植物為載體的免疫技術(shù)

4.1 植物疫苗免疫原性和免疫保護(hù)作用

由于植物疫苗一般是通過食用來被人體利用。所以如何避免消化酶的影響來保護(hù)抗原就是一個(gè)重要的研究課題。目前，避免消化酶的影響來保護(hù)抗原可分為2類方法：①用沙門氏菌和弧狀霍亂桿菌作為載體；②用保護(hù)性的包被對(duì)抗原進(jìn)行包裝。

用減毒的菌株可以把抗原引向粘膜的表面，有利于粘膜免疫系統(tǒng)攝取所表達(dá)的抗原。但是基于減毒菌株的方法具有潛在安全缺陷，而后者可通過生物降解的多聚物、脂質(zhì)體、蛋白質(zhì)體或者表達(dá)抗原的轉(zhuǎn)基因植物來實(shí)現(xiàn)。許多研究表明，植物材料可潛在地保護(hù)所選定的抗原。特別在種子中，植物可為亞單位疫苗提供一個(gè)富含蛋白酶抑制物的糖類聚合物基質(zhì)環(huán)境。其它的抗原包裝方法需要煩瑣的處理步驟；而通過植物種子來進(jìn)行生物包裝不需要任何額外的代價(jià)，就可以為這些抗原提供保護(hù)。在有關(guān)轉(zhuǎn)基因馬鈴薯的研究中，從輪狀病毒和產(chǎn)腸毒素大腸桿菌中所選的抗原分別與霍亂毒素的B和A2亞單位融合，抗原的免疫反應(yīng)顯示出對(duì)Th1的偏愛性，并可誘導(dǎo)白細(xì)胞介素2和干擾素γ，CD4 + 水平也相應(yīng)增加。Th1的偏愛性很可能是抗原或者載體的選擇結(jié)果。在佐劑的幫助下，亞單位疫苗的釋放能增加免疫反應(yīng)量。霍亂毒素和大腸桿菌的熱不穩(wěn)定毒素，它們與抗原共表達(dá)，有利于誘導(dǎo)保護(hù)性的免疫產(chǎn)生，改變口服免疫低效率遞呈。另外，有人證實(shí)了轉(zhuǎn)基因植物疫苗的粘膜傳輸中所誘發(fā)的免疫應(yīng)答所具有的黏膜佐劑的特征，這給口服免疫可不需佐劑提供了依據(jù)，同時(shí)也提高了其安全性。

在以植物疫苗的口服免疫研究中，所候選的亞單位疫苗也具有較好的保護(hù)作用。馬鈴薯塊莖或谷物種子中表達(dá)的熱不穩(wěn)定毒素的B 亞基和馬鈴薯中表達(dá)的霍亂毒素B 亞基用于小鼠口服免疫，可以保護(hù)老鼠免受痢疾的感染。另外，口服免疫由谷物種子表達(dá)的傳播性腸炎病毒的S2糖蛋白，對(duì)乳豬能夠起到很好的保護(hù)作用。目前，通過植物遞送系統(tǒng)來生產(chǎn)B 型肝炎的疫苗也逐漸成熟。

4.2 提高抗原在植物中的表達(dá)水平

利用植物進(jìn)行疫苗開發(fā)，首要的問題是，植物能否表達(dá)相關(guān)的蛋白？目前為止，許多亞單位候選抗原在轉(zhuǎn)基因植物中成功表達(dá)，這些抗原主要包括感染人類、家畜、野生動(dòng)物的細(xì)菌和病毒抗原。表達(dá)水平很大程度上取決于表達(dá)的蛋白和用于表達(dá)的植物種類，同時(shí)，構(gòu)建的表達(dá)系統(tǒng)也影響抗原的表達(dá)水平，比如用于表達(dá)的細(xì)胞器基因組(核和質(zhì)粒)、啟動(dòng)子的強(qiáng)度和組織專一性、非翻譯前導(dǎo)序列和信號(hào)序列的選擇和表達(dá)蛋白的靶細(xì)胞器的定位等均對(duì)表達(dá)產(chǎn)生影響。一般而言，利用上述策略可以實(shí)現(xiàn)抗原高水平表達(dá)。然而，很難對(duì)表達(dá)系統(tǒng)進(jìn)行比較，因?yàn)樘囟乖瓕?duì)植物表達(dá)系統(tǒng)的選擇很重要，在不同的系統(tǒng)中其表達(dá)效果是不一樣的。近來，研究人員利用內(nèi)質(zhì)網(wǎng)滯留信號(hào)可提高外源基因的表達(dá)量，Mason等利用一個(gè)核表達(dá)系統(tǒng)，把蛋白定位于內(nèi)質(zhì)網(wǎng)滯留信號(hào)之后，熱不穩(wěn)定毒素B亞單位在馬玲薯塊莖中表達(dá)量可達(dá)總可溶性蛋白質(zhì)的0.2% ；在谷物種子中的表達(dá)量約占總可溶蛋白的4%或12% ，這些都依賴于所用的調(diào)節(jié)序列。另外，霍亂毒素（B）亞單位在利用內(nèi)質(zhì)網(wǎng)滯留信號(hào)時(shí)在煙草葉片中的表達(dá)量約占總可溶蛋白的4%。膜蛋白比可溶性蛋白更難于在轉(zhuǎn)基因植物中表達(dá)，大量研究表明，膜蛋白在植物中的表達(dá)量遠(yuǎn)不及可溶性蛋白，這就需要優(yōu)化表達(dá)系統(tǒng)以提高表達(dá)水平。

目前，轉(zhuǎn)基因馬玲薯表達(dá)B型肝炎的表面抗原水平已由馬玲薯大約1mg/g增加到馬玲薯大約16mg/g抗原，這樣可以大大減少口服劑量。目前許多研究表明，所欲表達(dá)的抗原在植物中能夠表達(dá)并裝配成四級(jí)結(jié)構(gòu)。糖基化修飾的蛋白也可在植物中進(jìn)行糖基化，盡管糖基化模式很可能存在著差別。在植物系統(tǒng)中表達(dá)的熱不穩(wěn)定蛋白毒素的B亞單位和霍亂毒素的B亞單位，均有GM1受體結(jié)合活性，B型肝炎表面抗原和諾沃克病毒衣殼蛋白可形成類病毒顆粒，類病毒顆粒的形成，可認(rèn)為有利于誘導(dǎo)免疫反應(yīng)。

5 植物基因工程疫苗研究進(jìn)展

5.1 反轉(zhuǎn)錄病毒載體

反轉(zhuǎn)錄病毒作為載體是在進(jìn)行動(dòng)物基因工程中發(fā)現(xiàn)的，許多研究人員認(rèn)為它同樣適于植物基因工程，但目前研究的不多。

5.2 單鏈RNA植物病毒

單鏈RNA 植物病毒，即病毒RNA可直接作為mRNA的植物病毒，主要包括苜蓿花葉病毒(ALMV)、豇豆花葉病毒(CPMV)、雀麥花葉病毒(BMV)、煙草花葉病毒(TMV)等。它們作為外源基因載體主要通過以下步驟感染植物：病毒RNA 首先反轉(zhuǎn)錄為一條單鏈cDNA，在DNA聚合酶作用下形成雙鏈DNA，將其克隆入細(xì)菌質(zhì)粒中，將外源基因插入質(zhì)粒的cDNA中，最后通過體外轉(zhuǎn)錄，用帶有外源基因的RNA病毒感染植物，將其轉(zhuǎn)入植物細(xì)胞。

5.3單鏈DNA植物病毒載體

在單鏈DNA 植物病毒載體中，研究最多的是Geminiviruses(簡(jiǎn)稱GeNV) ，又叫做雙粒病毒或雙聯(lián)體病毒。它一般含有2個(gè)成對(duì)并存的病毒顆粒，大小約為18～20nm，遺傳物質(zhì)是單鏈DNA ,每2個(gè)顆粒中包含1～2個(gè)、2. 5～3.0 kb的環(huán)狀DNA分子。該病毒寄主廣泛，單子葉植物和雙子葉植物均可被感染，但感染部位僅限于植物的維管組織，且其傳播媒介主要是昆蟲，不能通過機(jī)械接種。

5.4 雙鏈DNA植物病毒載體

雙鏈DNA植物病毒載體中最典型的是花椰菜花葉病毒，它的基因組長(zhǎng)約8kb，主要感染花椰菜、油菜、擬南芥等，主要寄主是蕓苔屬植物，目前尚未發(fā)現(xiàn)可感染豆科和單子葉植物。

6 植物疫苗的安全性

6.1 對(duì)環(huán)境的影響

由于在植物疫苗中包含了病原體的DN段，因而花粉和種子的散播造成的基因逃逸可能給人類帶來新的病原、毒素、過敏原等，因此對(duì)可能引起的基因漸滲現(xiàn)象必須做出充分的安全性評(píng)價(jià),并規(guī)范植物疫苗的利用和管理，同時(shí)尋求技術(shù)方法。如可恢復(fù)阻塞(RBF)技術(shù)，它能使自然界中因漸滲而攜帶RBF 的雜種或近緣系植物死亡或不育或利用葉綠體轉(zhuǎn)化植物疫苗或培育植物疫苗的雄性不育系，這樣就可避免花粉傳播而帶來的潛在威脅，轉(zhuǎn)基因植物疫苗有著傳統(tǒng)疫苗無法比擬的優(yōu)越性，已經(jīng)成為一個(gè)研究熱點(diǎn)了。未來的研究應(yīng)著眼于生產(chǎn)出作為醫(yī)藥商品的安全、可靠、有效的植物疫苗。轉(zhuǎn)基因植物疫苗應(yīng)用最大的限制就是表達(dá)量低?，F(xiàn)在的研究表明：可以通過葉綠體轉(zhuǎn)化、植物育種和利用食品加工技術(shù)來提高表達(dá)水平，而且研究還指出，運(yùn)用攜帶蛋白和輔助蛋白可以增加抗原被免疫系統(tǒng)識(shí)別的能力。這些研究都使我們?cè)絹碓浇咏a(chǎn)出廉價(jià)“安全口服的商品植物疫苗”，這樣的疫苗將可以幫助人們預(yù)防疾病的傳播。

6.2對(duì)人類和動(dòng)物的影響

抗生素抗性基因是篩選轉(zhuǎn)基因植物常用的標(biāo)記基因。長(zhǎng)期食用這類轉(zhuǎn)基因疫苗是否會(huì)對(duì)人體或動(dòng)物造成抗生素醫(yī)療無效。轉(zhuǎn)基因植物中的新基因會(huì)不會(huì)傳遞給人畜腸道的正常微生物，引起菌群和數(shù)量的變化或插入并表達(dá)，從而危害人畜健康？這些問題目前都無法解答，仍需大量學(xué)者繼續(xù)研究論證。

7 展望

利用植物來表達(dá)和遞送疫苗技術(shù)的發(fā)展給免疫研究注入了新的內(nèi)容。以往的研究中,在植物中表達(dá)了包括過濾性病毒、細(xì)菌、腸道和非腸道的病原體等各種不同的抗原，并做了相應(yīng)免疫學(xué)研究。但植物疫苗面臨的最大問題是抗原蛋白在植物細(xì)胞表達(dá)量不高，低劑量抗原蛋白往往不能激發(fā)足夠的免疫反應(yīng)，這不能僅靠增加植物組織攝取量得以解決，因?yàn)榈蛣┝康闹貜?fù)免疫可能會(huì)導(dǎo)致機(jī)體的免疫耐受，導(dǎo)致機(jī)體對(duì)此抗原免疫反應(yīng)保持“低調(diào)”，即使以后增加抗原蛋白的劑量也不能改變。另外，機(jī)體每天對(duì)植物組織的攝取量是一定的，不可能無限增加。因此，未來研究的重點(diǎn)之一是提高植物疫苗中抗原蛋白的表達(dá)量。隨著生物技術(shù)的發(fā)展和植物基因工程研究的深入，基于植物的疫苗遞送系統(tǒng)將更具吸引力，并呈現(xiàn)出廣闊的應(yīng)用前景。

參考文獻(xiàn)

1 余祖華，王紅寧.用植物生物反應(yīng)器研制基因工程疫苗的進(jìn)展[J].生

物技術(shù)，2004（8）

篇(2)

【關(guān)鍵詞】 藥學(xué)院；基因工程藥物；公選課；意義；存在問題；改進(jìn)對(duì)策

基因工程是當(dāng)前自然科學(xué)中最引人注目的前沿學(xué)科之一，自誕生以來以其旺盛的生命力獲得了迅猛的發(fā)展，不僅給生命科學(xué)帶來了許多令世人矚目的成績(jī)，并且在化學(xué)、藥學(xué)等諸多領(lǐng)域均有著引人注目的發(fā)展前景。自1982年美國(guó)Lilly公司推出重組胰島素以來，基因工程藥物的出現(xiàn)與發(fā)展不僅有效控制了多種威脅人類健康的重大疾病，而且極大擴(kuò)展了疑難病癥的研究范圍，引起了現(xiàn)代醫(yī)藥行業(yè)的重大變革。因此，筆者于2007年起在學(xué)校開設(shè)《基因工程藥物》公選課，并對(duì)其教學(xué)內(nèi)容和方法進(jìn)行了一些思考和嘗試。

一、開設(shè)《基因工程藥物》公選課的意義

1、基因工程在藥學(xué)領(lǐng)域的應(yīng)用必將在21世紀(jì)成為自然科學(xué)發(fā)展的核心之一

早在上個(gè)世紀(jì)日本學(xué)者伊東光就斷言：“21世紀(jì)是生命科學(xué)的世紀(jì)?！苯裉欤@一預(yù)言已成為現(xiàn)實(shí)，人類生存與發(fā)展所面臨的許多重大問題都或多或少的與生命科學(xué)息息相關(guān)，這一點(diǎn)從近幾十年的許多諾貝爾獎(jiǎng)得主的科研成果中也可以看出。而在生命科學(xué)中，基因工程是它的基礎(chǔ)核心學(xué)科。所以，未來的自然科學(xué)的發(fā)展必然需要與基因工程相結(jié)合。

從科學(xué)的發(fā)展來看，現(xiàn)代學(xué)科的發(fā)展已不再是傳統(tǒng)的單一學(xué)科的發(fā)展，而是通過多學(xué)科的交叉滲透研究促進(jìn)所本學(xué)科的進(jìn)步，過去單一學(xué)科研究的問題現(xiàn)在很多已經(jīng)變成多學(xué)科共同關(guān)注的問題。由于基因工程對(duì)理工科各學(xué)科相關(guān)專業(yè)均可提供更廣闊的研究思路和重要的技術(shù)支持，因此基因工程現(xiàn)在已經(jīng)成為各專業(yè)發(fā)展中重要的研究方法和手段。大學(xué)教育也應(yīng)該適應(yīng)這一發(fā)展趨勢(shì)，結(jié)合基因工程在藥學(xué)領(lǐng)域中的應(yīng)用，開設(shè)《基因工程藥物》公選課能夠?yàn)槔砉た频膶W(xué)生打開一扇基因工程的窗戶，培養(yǎng)必要的學(xué)科交叉研究意識(shí)，為他們以后在本專業(yè)的發(fā)展上提供更廣闊的空間。

2、基因工程藥物對(duì)社會(huì)影響巨大，必須引起相關(guān)社會(huì)科學(xué)專業(yè)的重視

社會(huì)的發(fā)展與進(jìn)步是全面的，不是單一的；社會(huì)科學(xué)和自然科學(xué)同樣也不是涇渭分明、互不侵犯，而是在不斷的發(fā)展中有相互融合的趨勢(shì)。作為一個(gè)自然科學(xué)家，必須要具備相當(dāng)?shù)纳鐣?huì)科學(xué)常識(shí)，否則就有可能成為科學(xué)的狂人，社會(huì)的罪人，正如自然科學(xué)的發(fā)展促進(jìn)了工業(yè)革命之后的社會(huì)進(jìn)步，可是也造成了資源的浪費(fèi)和環(huán)境的污染。同樣，作為一個(gè)社會(huì)科學(xué)研究者或從業(yè)人員必須要具備自然科學(xué)的常識(shí)，能夠在研究或管理中正確使用相關(guān)知識(shí)，對(duì)待相關(guān)問題，更好的為社會(huì)服務(wù)。

今天的時(shí)代是信息的時(shí)代，社會(huì)中充斥著各種各樣的信息，如何能夠在紛繁復(fù)雜的信息中尋找或利用相關(guān)資料，就必須了解相關(guān)的知識(shí)；今天的時(shí)代也是科技的時(shí)代，各種高科技成果在生活中的廣泛使用，使得我們必須在管理中要通曉相關(guān)的概念?；蚬こ趟幬锏陌l(fā)展和進(jìn)步已經(jīng)對(duì)社會(huì)造成了巨大影響，其產(chǎn)業(yè)化過程中的產(chǎn)品和概念也在社會(huì)中隨處可見，它促進(jìn)了社會(huì)的進(jìn)步，也潛藏著各種安全性和倫理學(xué)問題。例如“基因治療”使得科學(xué)家具有“扮演上帝”的可能性，將引起基因爭(zhēng)奪戰(zhàn)和基因殖民主義等一系列倫理學(xué)和法律問題……在未來，隨著基因工程藥物品種的不斷增加，如何能夠在為人類造福的同時(shí)盡量減少其對(duì)社會(huì)產(chǎn)生的負(fù)面影響，是社會(huì)科學(xué)必須考慮的問題。所以，社會(huì)科學(xué)專業(yè)本科生作為未來社會(huì)的管理者和研究者，有必要對(duì)他們進(jìn)行基因工程藥物的啟蒙教育，這樣才能夠在未來讓基因工程藥物在社會(huì)上發(fā)揮更大的作用。

3、《基因工程藥物》公選課的開設(shè)對(duì)提高素質(zhì)教育質(zhì)量非常重要

由于我國(guó)在中等教育中采取了文理分科的方法，大多數(shù)高中在高一之后就開始文理分班，這使得本科生各專業(yè)之間有著極大的差別，理科生對(duì)于文科常識(shí)陌生，文科生對(duì)于理科知識(shí)不了解，這樣的培養(yǎng)方式非常不利于學(xué)生素質(zhì)的提高?！痘蚬こ趟幬铩纷鳛榍把匦詫W(xué)科對(duì)于科學(xué)的理論、方法論的傳播有著重要的意義，無論是哪個(gè)專業(yè)的學(xué)生，都可以通過這樣一門課較為系統(tǒng)的接受自然科學(xué)思想體系的訓(xùn)練，可以很大程度的提高學(xué)生的創(chuàng)造力和思維的延展性，從而不僅能讓理科生拓寬個(gè)人的眼界，也能讓文科生學(xué)習(xí)使用理工科的思維方式，對(duì)于消除文理之間的鴻溝起到重要作用。同時(shí)，在本科生的培養(yǎng)中，我們一貫強(qiáng)調(diào)“寬口徑、厚基礎(chǔ)、全面發(fā)展”，只關(guān)注與本專業(yè)、本學(xué)科的成就與發(fā)展，只會(huì)讓學(xué)生的發(fā)展之路越走越窄，如果我們要培養(yǎng)具有創(chuàng)新精神、實(shí)踐能力的高素質(zhì)人才，就不能閉門造車。

從另一方面來說，新世紀(jì)的競(jìng)爭(zhēng)越來越激烈，大學(xué)生承受著來自社會(huì)、家庭、個(gè)人越來越大的壓力，在錯(cuò)綜復(fù)雜的形勢(shì)面前，多一份知識(shí)的了解就會(huì)更有利于個(gè)人的進(jìn)步和社會(huì)的發(fā)展。所以，《基因工程》公選課的開設(shè)對(duì)大學(xué)生素質(zhì)教育的培養(yǎng)和提高非常重要。

二、《基因工程藥物》教學(xué)中存在的問題

1、對(duì)《基因工程藥物》學(xué)習(xí)意義認(rèn)識(shí)不足

開設(shè)《基因工程藥物》公選課的目的在于拓寬知識(shí)面，提升專業(yè)素養(yǎng)，培養(yǎng)創(chuàng)新能力，提高綜合素質(zhì)，但是對(duì)于學(xué)生而言，往往意識(shí)不到學(xué)習(xí)《基因工程藥物》的重要性。

首先，學(xué)生選課存在盲目性，導(dǎo)致學(xué)習(xí)缺乏針對(duì)性。通過和學(xué)生的交流筆者發(fā)現(xiàn)，一些學(xué)生選課的目的是出于對(duì)基因知識(shí)的好奇，而不是針對(duì)自身知識(shí)結(jié)構(gòu)查漏補(bǔ)缺，提升自身能力，還有一些學(xué)生選《基因工程藥物》是受別人影響，他們也不知道學(xué)這門課有什么用，周圍的或同寢室的同學(xué)選了自己就選了。這就導(dǎo)致部分學(xué)生學(xué)習(xí)缺乏興趣，也不知道該怎么學(xué)、學(xué)什么。其次，學(xué)生對(duì)于公選課不重視，學(xué)習(xí)態(tài)度不端正，導(dǎo)致缺乏學(xué)習(xí)的主動(dòng)性和自覺性。相當(dāng)一部分學(xué)生對(duì)《基因工程藥物》公選課的學(xué)習(xí)無所謂，認(rèn)為這又不是專業(yè)課，只是混個(gè)學(xué)分，即使上課，也沒打算好好學(xué)，沒有一個(gè)良好的心態(tài)，更沒有明確的學(xué)習(xí)規(guī)劃，這樣的學(xué)習(xí)效果可想而知。

2、學(xué)生來源復(fù)雜，程度參差不齊

和專業(yè)課不同，公選課的同學(xué)來自于不同院系不同專業(yè)，成分復(fù)雜。對(duì)于《基因工程藥物》這樣一門專業(yè)性很強(qiáng)的課程來說，專業(yè)的區(qū)別只是一個(gè)方面，更重要的是不同專業(yè)的學(xué)生對(duì)于課程的需求各有不同，給授課帶來一些困難。例如對(duì)于理工科相關(guān)專業(yè)的學(xué)生來說，他們的要求可能就要深入一些，相關(guān)的概念、理論理解起來也較為容易；但是對(duì)于一些文科學(xué)生而言，可能更希望獲得一些科普性質(zhì)的知識(shí)，太過于專業(yè)會(huì)讓他們產(chǎn)生畏難心理，不利于進(jìn)一步的學(xué)習(xí)。如何做到因材施教，是筆者在教學(xué)中始終面臨的問題。

三、《基因工程藥物》教學(xué)改進(jìn)對(duì)策

1、端正認(rèn)識(shí)，提高興趣

由于許多學(xué)生選《基因工程藥物》缺乏明顯的目的性，對(duì)上課當(dāng)然就沒有興趣。所以，第一節(jié)課特別重要，不能使用過于專業(yè)的語言闡述基因工程藥物的相關(guān)概念和理論，這樣會(huì)讓學(xué)生畏懼。要從學(xué)習(xí)《基因工程藥物》的意義談起，例如重組生長(zhǎng)激素和侏儒癥、如何正確對(duì)待流感疫苗等生活中、社會(huì)中常見的、有趣的案例入手，從科學(xué)的發(fā)展方向出發(fā)，使學(xué)生意識(shí)到學(xué)習(xí)這門課無論對(duì)現(xiàn)在的專業(yè)學(xué)習(xí)還是對(duì)未來的深造、就業(yè)都會(huì)產(chǎn)生難以估量的好處，不僅要讓學(xué)生在第一節(jié)課中產(chǎn)生對(duì)這門課的濃厚興趣，更要讓學(xué)生認(rèn)識(shí)到通過學(xué)習(xí)可以給他們帶來實(shí)際的價(jià)值，從而增加他們學(xué)習(xí)的主動(dòng)性和能動(dòng)性。

當(dāng)然，僅靠一節(jié)課遠(yuǎn)遠(yuǎn)不夠，要想每一節(jié)課都能留住學(xué)生的興趣，就要每一節(jié)課都能滿足他們的求知欲和好奇心，筆者在每一節(jié)課上都以實(shí)際發(fā)生的案例引入，盡量使用淺顯、通俗、易懂的語言講述相關(guān)的概念，重點(diǎn)放在概念和理論的引申上，因?yàn)楣x課的學(xué)生都來自于不同專業(yè)，有文有理，不能像本專業(yè)的學(xué)生一樣講的深入，而是要在廣博上下功夫。例如從《逃離克隆島》片段引入，介紹克隆的相關(guān)知識(shí)和原理，最后 討論在倫理學(xué)、法 學(xué)、社會(huì)學(xué)等領(lǐng)域?qū)Α搬t(yī)學(xué)克隆”的認(rèn)識(shí)和爭(zhēng)論；結(jié)合“甲型H1N1流感”，從基因角度講述疫苗的研制、生產(chǎn)，說明基因工程藥物在實(shí)際生活中的巨大用處等。這樣做的優(yōu)點(diǎn)是每一個(gè)專業(yè)的學(xué)生總能從課堂上找到和本專業(yè)相關(guān)的切入點(diǎn)，減少了距離感，增加了學(xué)生的興趣。

2、重在普及，強(qiáng)調(diào)重點(diǎn)

公選課的教學(xué)畢竟和專業(yè)課在授課對(duì)象上有較大差距，所以要有所區(qū)別，專業(yè)課的教學(xué)強(qiáng)調(diào)概念準(zhǔn)確、原理清晰、深入透徹，要讓學(xué)生不僅“知其然”，還要“知其所以然”，要花很多時(shí)間在各種理論的說明和推導(dǎo)上。而公選課則不然，學(xué)生的目的各不相同，不同的需求會(huì)導(dǎo)致不同的學(xué)習(xí)行為，過于專業(yè)的講授可能會(huì)讓本專業(yè)的學(xué)生滿意，但可能會(huì)讓公選課的學(xué)生覺著索然無味。同時(shí)由于很多文科學(xué)生缺乏理工科的訓(xùn)練，一些專業(yè)的知識(shí)會(huì)讓他們摸不著頭腦。因此，很多時(shí)候要把《基因工程藥物》公選課當(dāng)做科普課上，做好自然科學(xué)的普及工作，給予學(xué)生一些課程的基礎(chǔ)訓(xùn)練。

同時(shí)，對(duì)于一些理工科的學(xué)生也要滿足他們的求知欲，要在一些可能會(huì)引起他們興趣的要點(diǎn)上，用其他專業(yè)的方式或語言，如醫(yī)學(xué)、化學(xué)、環(huán)境工程等，較為深入的講述相關(guān)理論，這樣做既能引起他們興趣，又能讓他們更快、更深刻的理解概念。

3、加強(qiáng)交流，嘗試講座式教學(xué)

學(xué)生是我們服務(wù)的對(duì)象，了解他們的需求筆者認(rèn)為是最重要的。所以課前課后，筆者總是早到晚走，在講臺(tái)下和學(xué)生溝通，了解他們的所思所想和感興趣的地方，按專業(yè)分成小組，指定組長(zhǎng)，定期收集學(xué)生對(duì)授課內(nèi)容的反饋，對(duì)授課過程中的問題第一時(shí)間解決，鼓勵(lì)學(xué)生提問題，授課內(nèi)容也會(huì)針對(duì)學(xué)生的需求做適當(dāng)調(diào)整。例如2008年北京奧運(yùn)會(huì)期間，有學(xué)生無意中提出是否有“基因工程興奮劑”？筆者針對(duì)這一問題組織了促紅細(xì)胞生成素、生長(zhǎng)激素等基因工程藥物的學(xué)習(xí)，并啟發(fā)學(xué)生進(jìn)行基因工程藥物的倫理學(xué)討論，激發(fā)學(xué)生的學(xué)習(xí)興趣。

此外，傳統(tǒng)的教學(xué)方式容易引起學(xué)生的反感，讓他們覺著上課內(nèi)容和他們無關(guān)，極易造成學(xué)生的課堂流失，而討論式、專題式的教學(xué)方式最能夠調(diào)到學(xué)生的學(xué)習(xí)的主動(dòng)性和創(chuàng)造性。因此筆者采用講座式的授課方式，課程內(nèi)容不依照教材章節(jié)，而是按學(xué)生需求分成不同內(nèi)容的講座，課上加強(qiáng)互動(dòng)，使學(xué)生不是被動(dòng)的接受知識(shí)，而是成為課堂的主人。每一次課的最后都要留出一部分時(shí)間，鼓勵(lì)學(xué)生提問、討論和交流，讓他們主動(dòng)思考，激發(fā)他們活躍的思維。例如“基因工程疫苗”一章，在最初兩年是以“乙肝疫苗”為例進(jìn)行學(xué)習(xí)，但在2009年后就改為“甲型H1N1流感疫苗”，并結(jié)合“甲型H1N1流感疫苗”和“乙肝疫苗”兩者的對(duì)比，使學(xué)生正確對(duì)待疫苗的使用。

4、利用多媒體手段，加強(qiáng)啟發(fā)式教學(xué)

《基因工程藥物》課程的信息量較大，也比較抽象，利用現(xiàn)代的多媒體手段可以形象、細(xì)致的展示相關(guān)內(nèi)容，能夠讓學(xué)生得到直接的體驗(yàn)，強(qiáng)低了學(xué)習(xí)和理解的難度。如播放一些電影、電視節(jié)目等，通過討論讓學(xué)生說出從基因和自己專業(yè)相結(jié)合的角度在視頻資料中看到了什么，能想到什么，啟發(fā)學(xué)生獨(dú)立自主的用基因的知識(shí)去思考。所以，要多利用、善于利用視頻影像資料，制作精良的課件授課。例如，利用“記者探秘我國(guó)甲型H1N1流感疫苗生產(chǎn)過程”的視頻，使學(xué)生對(duì)于疫苗的制備流程，以及正確使用等有了直觀的、系統(tǒng)的認(rèn)識(shí)；再比如“醫(yī)學(xué)克隆”一章，首先讓學(xué)生觀看《逃離克隆島》片段，然后利用專業(yè)知識(shí)對(duì)電影中的某些細(xì)節(jié)進(jìn)行描述，引出克隆在醫(yī)學(xué)上的應(yīng)用，使學(xué)生能夠從較為專業(yè)的角度理解“醫(yī)學(xué)克隆”，從而達(dá)到教學(xué)目的。

總之，開設(shè)公選課的目的是希望通過授課為學(xué)生打開一扇窗，讓他們了解并能夠簡(jiǎn)單使用基因工程相關(guān)理論，因此，要在啟發(fā)學(xué)生思維上下功夫，我們甚至可以說，在這門課上學(xué)到什么并不十分重要，在學(xué)習(xí)基因工程藥物的過程中想到了什么才是最重要的。

【參考文獻(xiàn)】

[1]汪燕芳，何俊民，朱云國(guó).談“現(xiàn)代生物技術(shù)導(dǎo)論”公選課的開設(shè)思路[J].高教論壇，2008（1）.

【作者簡(jiǎn)介】

任雪玲，女，河南鄭州人，鄭州大學(xué)藥學(xué)院副教授、博士，研究方向：基因工程藥物分析.

篇(3)

[關(guān)鍵詞] 傳染性支氣管炎 疫苗 研究

[中圖分類號(hào)] S831 [文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼] A [文章編號(hào)] 1003-1650 （2016）08-0247-01

雞傳染性支氣管炎 （IB）是由雞傳染性支氣管炎病毒（IBV）引起，嚴(yán)重危害我國(guó)養(yǎng)禽業(yè)的一種重要疾病。各年齡階段雞均可發(fā)病，但雛雞最為嚴(yán)重，一般以40日齡以內(nèi)的雞多發(fā)，產(chǎn)蛋期也有發(fā)生。IBV較高的基因突變率造成了IBV 復(fù)雜的血清型，目前的血清學(xué)交叉中和試驗(yàn)表明，全世界IBV已有近30個(gè)血清型，并仍有不斷上升的趨勢(shì)，且各血清型或毒株之間交叉保護(hù)性較弱，從而給本病的防控帶來較大的困難，急需研制新的疫苗有效的預(yù)防該病的發(fā)生。

1 滅活疫苗

滅活疫苗安全性好，不存在散播病原和毒力返強(qiáng)的問題，但是，由于IB血清型的多樣性，單價(jià)滅活苗不能阻止IBV變異株引起IB的暴發(fā)。王紅寧等（1999）對(duì)我國(guó)IB的流行病學(xué)進(jìn)行調(diào)查研究，試制了多價(jià)油乳劑滅活疫苗，擴(kuò)大常規(guī)疫苗的保護(hù)范圍，發(fā)現(xiàn)能有效地預(yù)防多型IB。滅活疫苗的不足之處是使用劑量大，需要配合佐劑， 制備比較復(fù)雜、成本較高等。為有效的防治該病的發(fā)生，目前，國(guó)內(nèi)多將弱毒疫苗滴鼻和滅活疫苗注射結(jié)合起來使用。

2 IB弱毒疫苗

IB 弱毒疫苗是由抗原性良好的毒株通過雞胚連續(xù)傳代致弱后制備的凍干疫苗。目前我國(guó)廣泛使用M41 血清型的雞胚適應(yīng)毒H52和H120兩種疫苗。為達(dá)到較好的免疫效果，多在早期育雛防控，H120 株疫苗用于雛雞和其它日齡的雞，H52用于經(jīng) H120 免疫過的大雞，育成雞開產(chǎn)時(shí)選用 H52 疫苗，能有效刺激機(jī)體的免疫系統(tǒng)。但鑒于弱毒疫苗有可能成為其突變的主體和重組變異的供體，同時(shí)腎型與支氣管炎型的免疫機(jī)制還存在著很大的差別，這在很大程度上亦影響著疫苗的免疫保護(hù)作用。并且，活疫苗其致弱程度難以掌握，疫苗的運(yùn)輸、貯存和使用等的條件要求較高。秦玉明等（2009）應(yīng)用耐熱凍干保護(hù)劑研制成功雞傳染性支氣管炎病毒（H52株）耐熱凍干活疫苗，臨床觀察無不良反應(yīng)，安全有效，且抗原性不變，徹底改變國(guó)內(nèi)獸用生物制品延續(xù)了 20多年采用脫脂牛奶制備活疫苗僅-15 ℃保存的歷史，達(dá)到國(guó)外同類產(chǎn)品的技術(shù)水平。

3 基因工程疫苗

3.1 亞單位疫苗

亞單位疫苗是指用基因工程方法構(gòu)建，在高效表達(dá)系統(tǒng)中表達(dá)出來強(qiáng)毒病原體的某種免疫相關(guān)抗原肽鏈。提取保護(hù)性抗原，加入佐劑即制成亞單位疫苗。常用的表達(dá)系統(tǒng)為大腸桿菌表達(dá)系統(tǒng)、酵母表達(dá)系統(tǒng)、昆蟲細(xì)胞表達(dá)系統(tǒng)和植物表達(dá)系統(tǒng)。黃亞東等（2002）構(gòu)建了含BIV GD6株S1基因的大腸桿菌重組表達(dá)載體，并在大腸桿菌中獲得表達(dá)。又在畢赤酵母中表達(dá)了IBV的S1基因，所表達(dá)蛋白的分子量小于天然蛋白。戴亞斌等利用Bac-to- Bac桿狀病毒表達(dá)系統(tǒng)構(gòu)建的重組桿狀病毒，表達(dá)了傳染性支氣管炎病毒的S1基因，其在昆蟲細(xì)胞中表達(dá)的蛋白可以誘導(dǎo)抗體產(chǎn)生中和免疫保護(hù)反應(yīng)。周繼勇等（2003）利用根瘤菌將IBV全長(zhǎng)S 基因轉(zhuǎn)入馬鈴薯中表達(dá)，提取免疫原免疫雞，通過3次免疫后，免疫雞受到完全保護(hù)。王紅寧等（2003）通過RT-PCR獲得IBV S1基因片段，并將其導(dǎo)入玉米表達(dá)載體進(jìn)行了表達(dá)。

3.2 核酸疫苗

核酸疫苗由編碼能引起保護(hù)性免疫反應(yīng)的病原體抗原的基因片段和載體構(gòu)建而成，在構(gòu)建多價(jià)疫苗方面具有突出的優(yōu)勢(shì)。陳洪巖（1999）、劉思國(guó)等（2001）分別將IBV S1基因和N基因構(gòu)建成真核表達(dá)質(zhì)粒， SPF雞肌肉注射后，結(jié)果目的基因在雞體內(nèi)得到了表達(dá)，雞獲得了一定的免疫力。Minglong 用含IBV N 蛋白C末端120 aa 的cDNA 片段的重組質(zhì)粒接種雛雞，證實(shí)了在缺乏S1蛋白時(shí)，N 蛋白也可以作為DNA疫苗免疫的目的基因，保護(hù)雛雞抵抗急性感染。

3.3 活病毒載體疫苗

活病毒載體疫苗是用利用分子生物學(xué)遺傳工程技術(shù)將保護(hù)性抗原基因整合進(jìn)載體基因組中，構(gòu)建成使之表達(dá)的重組活載體疫苗。Wang X等（2002）用重組雞痘病毒表達(dá)了IBV的S1基因，免疫雞受到部分保護(hù)。Yu等（2003）用重組雞痘病毒表達(dá)IBV的C末端NL蛋白120個(gè)氨基酸進(jìn)行預(yù)防研究，誘導(dǎo)了一些IBV株交叉保護(hù)免疫，可以很好的抵制和預(yù)防IBV強(qiáng)毒的攻擊。孫永科等（2005）將雞II型干擾素基因和雞傳染性支氣管炎病毒S1基因同時(shí)插入到雞痘病毒轉(zhuǎn)移載體中，重組雞痘病毒疫苗在對(duì)雞體的免疫應(yīng)答中發(fā)揮了一定的作用。Johnson MA 等（2003）利用禽 8 型腺病毒表達(dá) IBV S1 基因，對(duì)0日齡和6日齡雞分別進(jìn)行口服免疫，35 日齡時(shí)用同型或異型強(qiáng)毒株進(jìn)行攻毒，試驗(yàn)結(jié)果顯示，對(duì)于 IBV 同源和異源毒株在支氣管的保護(hù)率達(dá)到 90%～100%。

篇(4)

關(guān)鍵詞：基因工程；發(fā)展現(xiàn)狀；發(fā)展前景；基因工程利弊

一、基因工程

（一）基因工程的概念及發(fā)展

1.概念

基因工程又稱基因拼接技術(shù)和DNA重組技術(shù)，是以分子遺傳學(xué)為理論基礎(chǔ)，以分子生物學(xué)和微生物學(xué)的現(xiàn)代方法為手段，將不同來源的基因按預(yù)先設(shè)計(jì)的藍(lán)圖，在體外構(gòu)建雜種DNA分子，然后導(dǎo)入活細(xì)胞，以改變生物原有的遺傳特性、獲得新品種、生產(chǎn)新產(chǎn)品。

2.發(fā)展

生物學(xué)家于20 世紀(jì)50 年現(xiàn)了DNA 的雙螺旋結(jié)構(gòu)，從微觀層面更進(jìn)一步認(rèn)識(shí)了人類及其他生物遺傳的物質(zhì)載體，這是人類在生物研究方面的一次重大突破。60 年代以后，科學(xué)家開始破譯生物遺傳基因的遺傳密碼，簡(jiǎn)單地說，就是將控制生物遺傳特征的每一種基因的核苷酸排列順序弄清楚。在搞清楚某些單個(gè)基因的核苷酸排列順序基礎(chǔ)上，進(jìn)而進(jìn)行有計(jì)劃、大規(guī)模地對(duì)人類、水稻等重要生物體的全部基因圖譜進(jìn)行測(cè)序和詮釋。

（二）基因工程的發(fā)展現(xiàn)狀及前景

1.發(fā)展現(xiàn)狀

（1）基因工程應(yīng)用于農(nóng)業(yè)方面。運(yùn)用基因工程方法，把負(fù)責(zé)特定的基因轉(zhuǎn)入農(nóng)作物中去，構(gòu)建轉(zhuǎn)基因植物，有抗病蟲害，抗逆，保鮮，高產(chǎn)，高質(zhì)的優(yōu)點(diǎn)。

下面列舉幾個(gè)代表性方法。

①增加農(nóng)作物產(chǎn)品營(yíng)養(yǎng)價(jià)值如：增加種子、塊莖蛋白質(zhì)含量，改變植物蛋白必需氨基酸比例等。

②提高農(nóng)作物抗逆性能如：抗病蟲害、抗旱、抗?jié)?、抗除草劑等性能?/p>

③生物固氮的基因工程。若能把禾谷等非豆科植物轉(zhuǎn)變?yōu)槟芡鼍采?，或具固氮能力，將代替無數(shù)個(gè)氮肥廠。④增加植物次生代謝產(chǎn)物產(chǎn)率。植物次生代謝產(chǎn)物構(gòu)成全世界藥物原料的 25% ，如治療瘧疾的奎寧、治療白血病的長(zhǎng)春新堿、治療高血壓的東莨菪堿、作為麻醉劑的嗎啡等。

⑤運(yùn)用轉(zhuǎn)基因動(dòng)物技術(shù)，可培育畜牧業(yè)新品種。

二、基因工程應(yīng)用于醫(yī)藥方面

目前，以基因工程藥物為主導(dǎo)的基因工程應(yīng)用產(chǎn)業(yè)已成為全球發(fā)展最快產(chǎn)業(yè)之一，前景廣闊?；蚬こ趟幬镏饕?xì)胞因子、抗體、疫苗、激素和寡核甘酸藥物等。對(duì)預(yù)防人類腫瘤、心血管疾病、遺傳病、糖尿病、包括艾滋病在內(nèi)的各種傳染病、類風(fēng)濕疾病等有重要作用。我們最為熟悉的干擾素（IFN）就是一類利用基因工程技術(shù)研制成的多功能細(xì)胞因子，在臨床上已用于治療白血病、乙肝、丙肝、多發(fā)性硬化癥和類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎等多種疾病。 并且應(yīng)用基因工程研制的艾滋病疫苗已完成中試，并進(jìn)入臨床驗(yàn)證階段；專門用于治療腫瘤的“腫瘤基因?qū)棥币矊⒃诓痪猛瓿裳兄?，它可有目的地尋找并殺死腫瘤，將使癌癥的治愈成為可能。

三、基因工程應(yīng)用于環(huán)保方面

工業(yè)發(fā)展以及其它人為因素造成的環(huán)境污染已遠(yuǎn)遠(yuǎn)超出了自然界微生物的凈化能力，基因工程技術(shù)可提高微生物凈化環(huán)境的能力。美國(guó)利用DNA 重組技術(shù)把降解芳烴、萜烴、多環(huán)芳烴、脂肪烴的4 種菌體基因鏈接，轉(zhuǎn)移到某一菌體中構(gòu)建出可同時(shí)降解4 種有機(jī)物的“超級(jí)細(xì)菌”，用之清除石油污染，在數(shù)小時(shí)內(nèi)可將水上浮油中的2/3 烴類降解完，而天然菌株需 1 年之久。90 年代后期問世的DNA 改組技術(shù)可以創(chuàng)新基因，并賦予表達(dá)產(chǎn)物以新的功能，創(chuàng)造出全新的微生物，如可將降解某一污染物的不同細(xì)菌的基因通過PCR 技術(shù)全部克隆出來，再利用基因重組技術(shù)在體外加工重組，最后導(dǎo)入合適的載體，就有可能產(chǎn)生一種或幾種具有非凡降解能力的超級(jí)菌株，從而大大地提高降解效率。

（一）發(fā)展前景

基因工程應(yīng)用重組DNA 技術(shù)培育具有改良性狀的糧食作物的工作已初見成效。重組DNA 技術(shù)的一個(gè)顯著特點(diǎn)是，它注往可以使一個(gè)生物獲得與之固有性狀完全無關(guān)的新功能，從而引起生物技術(shù)學(xué)發(fā)生革命性的變革，使人們可以在大量擴(kuò)增的細(xì)胞中生產(chǎn)哺乳動(dòng)物的蛋白質(zhì)，其意義無疑是相當(dāng)重大的。將控制這些藥物合成的目的基因克隆出來，轉(zhuǎn)移到大腸桿菌或其它生物體內(nèi)進(jìn)行有效的表達(dá)，于是就可以方便地提取到大量的有用藥物。目前在這個(gè)領(lǐng)域中已經(jīng)取得了許多成功的事例，其中最突出的要數(shù)重組胰島素的生產(chǎn)。 重組DNA 技術(shù)還有力地促進(jìn)了醫(yī)學(xué)科學(xué)研究的發(fā)展。它的影響所及有疾病的臨床診斷、遺傳病的基因治療、新型疫苗的研制以及癌癥和艾滋病的研究等諸多科學(xué)，并且均已取得了相當(dāng)?shù)某删汀?/p>

（二）基因工程的利與弊

1.基因工程的利

遺傳疾病乃是由于父或母帶有錯(cuò)誤的基因?；蚝Y檢法可以快速診斷基因密碼的錯(cuò)誤；基因治療法則是用基因工程技術(shù)來治療這類疾病。產(chǎn)前基因篩檢可以診斷胎兒是否帶有遺傳疾病，這種篩檢法甚至可以診斷試管內(nèi)受精的胚胎，早至只有兩天大，尚在八個(gè)細(xì)胞階段的試管胚胎。做法是將其中之一個(gè)細(xì)胞取出，抽取DNA，偵測(cè)其基因是否正常，再?zèng)Q定是否把此胚胎植入母親的子宮發(fā)育。胎兒性別同時(shí)也可測(cè)知。 基因篩檢并不改變?nèi)说倪z傳組成，但基因治療則會(huì)。目前全世界正重視發(fā)展永續(xù)性農(nóng)業(yè)，希望農(nóng)業(yè)除了具有經(jīng)濟(jì)效益，還要生生不息，不破壞生態(tài)環(huán)境?；蚬こ陶蓭兔鉀Q這類問題?；蚬こ炭梢愿牧嫁r(nóng)糧作物的營(yíng)養(yǎng)成分或增強(qiáng)抗病抗蟲特性?？梢栽黾有笄蓊惖纳L(zhǎng)速率、牛羊的泌乳量、改良肉質(zhì)及脂肪含量等。

2.基因工程的弊

廣泛的基因篩檢將會(huì)引起一連串的社會(huì)問題。雖然基因篩檢可幫助醫(yī)生更早期更有效地治療病人，但可能妨礙他的未來生活就業(yè)?；蚬こ虝?huì)產(chǎn)生“殺蟲劑”的作物，也可能對(duì)大環(huán)境有害，它們或許會(huì)殺死不可預(yù)期的益蟲，影響昆蟲生態(tài)的平衡。轉(zhuǎn)基因食品不同于相同生物來源之傳統(tǒng)食品，遺傳性狀的改變，將可能影響細(xì)胞內(nèi)之蛋白質(zhì)組成，進(jìn)而造成成份濃度變化或新的代謝物生成，其結(jié)果可能導(dǎo)致有毒物質(zhì)產(chǎn)生或引起人的過敏癥狀，甚至有人懷疑基因會(huì)在人體內(nèi)發(fā)生轉(zhuǎn)移，造成難以想象的后果。轉(zhuǎn)基因食品潛在危害包括：食物內(nèi)所產(chǎn)生的新毒素和過敏原；不自然食物所引起其它損害健康的影響；應(yīng)用在農(nóng)作物上的化學(xué)藥品增加水和食物的污染；抗除草劑的雜草會(huì)產(chǎn)生；疾病的散播跨越物種障礙；農(nóng)作物的生物多樣化的損失；生態(tài)平衡的干擾。

四、結(jié)束語

隨著社會(huì)科技的進(jìn)步，基因工程的發(fā)展將成為必然。盡管它會(huì)給我們帶來一些危害但是仍然為我們帶來了很多好處。不僅為我們提供了新的能源而且促進(jìn)了各國(guó)的經(jīng)濟(jì)的發(fā)展，所以在我們發(fā)展基因工程的同時(shí)應(yīng)該盡力避免一些危害，而讓有利的方面盡可能應(yīng)用。

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[3]劉祥林.聶劉旺.2005.基因工程.北京：科學(xué)出版社

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1.了解活疫苗和死疫苗的特點(diǎn)

死疫苗是選用免疫原性好的細(xì)菌、病毒、立克次氏體等，經(jīng)人工培養(yǎng)，再用物理或化學(xué)方法將其殺滅制成的。此種疫苗失去繁殖能力，但保留免疫原性。死疫苗進(jìn)入機(jī)體后不能生長(zhǎng)繁殖，對(duì)機(jī)體刺激時(shí)間短，要獲得持久免疫力需多次重復(fù)接種。死疫苗按佐劑不同分為3種：一是蜂膠佐劑滅活疫苗。蜂膠可增強(qiáng)免疫的效果，減輕注苗反應(yīng)。這類滅活疫苗作用時(shí)間比較快，但制苗工藝要求高，需高濃縮抗原配制。二是油佐劑滅活疫苗。這類疫苗為滅活疫苗，以白油為佐劑乳化而成，大多數(shù)病毒性滅活疫苗采用這種方式。油佐劑疫苗注入機(jī)體后，疫苗中的抗原物質(zhì)緩慢釋放，從而延長(zhǎng)疫苗的作用時(shí)間。三是鋁膠佐劑疫苗。以鋁膠按一定比例混合而成，大多數(shù)細(xì)菌性滅活疫苗采用這種方式，疫苗作用時(shí)間比油佐劑疫苗快。死疫苗一般在2-8℃避光保存，不宜凍結(jié)，有效期一年。使用前需充分搖勻，用量較大，對(duì)豬體的副作用也大，一般要少量多次接種。其優(yōu)點(diǎn)是容易保存，安全，毒力不能返強(qiáng)，不存在散毒和造成新疫源的危險(xiǎn)，容易制成聯(lián)苗。

活疫苗可通過從帶菌者中分離毒力弱的菌株獲得，也可通過人工培養(yǎng)，使微生物產(chǎn)生變異，從毒力弱的菌株中獲得。接種后在體內(nèi)有生長(zhǎng)繁殖能力，接近于自然感染，可激發(fā)機(jī)體對(duì)病原的持久免疫力?；钜呙缬昧枯^小，免疫持續(xù)時(shí)間較長(zhǎng)，免疫效果優(yōu)于死疫苗。大多數(shù)的活疫苗都采用冷凍真空干燥的方式凍干保存，以延長(zhǎng)疫苗的保存時(shí)間，保持疫苗的效價(jià)。病毒性凍干疫苗常在- 15℃以下保存，保存期一般為兩年。細(xì)菌性凍干疫苗在- 15cc保存時(shí)保存期一般為兩年，2-8℃保存時(shí)保存期為9個(gè)月。當(dāng)活疫苗接種到豬體后，能在一定部位繁殖一段時(shí)期，但由于毒力弱，不會(huì)引發(fā)疾病，而能使豬體產(chǎn)生免疫力?；钜呙缬昧可?，副作用小，只需接種一次，但不易保存。

2.區(qū)分不同情況選用活疫苗或死疫苗

疫苗從來源上又分為免費(fèi)疫苗和自費(fèi)疫苗。免費(fèi)疫苗是指政府免費(fèi)向養(yǎng)豬戶提供，養(yǎng)豬戶應(yīng)當(dāng)依照政府規(guī)定的強(qiáng)制免疫項(xiàng)目受種的疫苗；自費(fèi)疫苗是指由養(yǎng)豬戶自費(fèi)并且自愿受種的其他疫苗。

免費(fèi)疫苗有3種：一是口蹄疫病毒疫苗。目前我縣選用的口蹄疫疫苗是一種滅活的疫苗。二是豬瘟疫苗。常用豬瘟細(xì)胞活疫苗和脾淋活疫苗，60日齡前基礎(chǔ)免疫可用細(xì)胞活疫苗，60日齡后加強(qiáng)免疫可用脾淋活疫苗。三是高致病性藍(lán)耳病疫苗。生產(chǎn)實(shí)踐證明，陽性豬群使用活疫苗效果更好。

自費(fèi)疫苗主要有8種：一是豬鏈球菌病疫苗。目前較多使用的豬敗血性鏈球菌病活疫苗對(duì)預(yù)防C群豬鏈球菌病有很好的效果，而對(duì)一些血清型流行比較復(fù)雜的地區(qū)可考慮使用豬鏈球菌多價(jià)滅活疫苗。二是日本乙型腦炎疫苗。用活疫苗可有效防止乙型腦炎的發(fā)生。三是豬細(xì)小病毒病疫苗。用滅活疫苗較好。四是仔豬大腸桿菌性腹瀉波疫苗。目前常用且效果不錯(cuò)的有仔豬大腸桿菌基因工程四價(jià)滅活疫苗、仔豬大腸桿菌基因工程三價(jià)滅活疫苗、仔豬大腸桿菌基因工程二價(jià)滅活疫苗等。五是病毒性腹瀉疫苗。常用的疫苗有豬傳染性胃腸炎和豬流行性腹瀉二聯(lián)滅活疫苗、豬傳染性胃腸炎和輪狀病毒二聯(lián)活疫苗等。六是豬喘氣病疫苗。用進(jìn)口的豬喘氣病滅活疫苗可取得滿意效果。七是副豬嗜血桿菌病疫苗?？蛇x用油乳劑滅活苗。八是豬偽狂犬病疫苗。用豬偽狂犬病活 疫苗效果更佳。

篇(6)

1PEA的基礎(chǔ)研究概述

中外學(xué)者對(duì)PEA的研究已有將近40年的歷史，早期的研究大部分集中在其分子結(jié)構(gòu)及各部分結(jié)構(gòu)的功能等方面。20世紀(jì)90年代以來，隨著基因工程技術(shù)的飛速發(fā)展和分子生物學(xué)方法的逐步完善，從綠膿桿菌的基因組全序列入手，對(duì)其基因序列與功能的相關(guān)性以及利用這一相關(guān)性所展開的開發(fā)研究得到進(jìn)一步深化［2］。

1.1PEA的結(jié)構(gòu)和功能PEA是613肽的單鏈毒素蛋白，分子量為66MD，由信號(hào)肽和常用肽構(gòu)成。其常用肽由3個(gè)結(jié)構(gòu)功能區(qū)組成。功能區(qū)Ⅰ又分為大區(qū)Ia(第1～252位氨基酸)和小區(qū)Ib(第365－399位氨基酸)。三個(gè)功能區(qū)因其特異的氨基酸序列、分子結(jié)構(gòu)及在肽鏈上的不同位置決定其分別同時(shí)行使其細(xì)胞毒性所必需的三種不同功能。區(qū)Ⅰ和區(qū)Ⅲ(第400～613位氨基酸)分別處于PEA分子的氨基端(N端)和羧基端(C端)，分別行使細(xì)胞結(jié)合功能和ADP－核糖基化作用。區(qū)Ⅰ的細(xì)胞結(jié)合功能主要通過區(qū)Ⅰa與靶細(xì)胞表面受體結(jié)合來實(shí)現(xiàn)，區(qū)Ⅲ因其含有在三級(jí)結(jié)構(gòu)中形成折疊時(shí)起決定作用的8個(gè)半胱氨酸和4個(gè)雙硫鍵而使其成為PEA發(fā)揮細(xì)胞毒性的關(guān)鍵功能區(qū)。目前的研究表明，區(qū)Ⅰb的大部分即使缺失也不會(huì)影響PEA的生物學(xué)活性，由此推斷其在PEA細(xì)胞毒性中的確切作用尚不明確。功能區(qū)Ⅱ(第253～364位氨基酸)包含6個(gè)連續(xù)的α螺旋，有助其實(shí)現(xiàn)毒素的跨膜轉(zhuǎn)位功能。

1.2PEA的產(chǎn)生、分離、純化和鑒定PEA是綠膿桿菌在其生長(zhǎng)增殖過程中產(chǎn)生的一種重要代謝產(chǎn)物，大多數(shù)體綠膿桿菌菌株都會(huì)生成PEA。但在其液體培養(yǎng)基中PEA含量少，濃度低，提取相當(dāng)困難。而且不同的綠膿桿菌菌株、不同培養(yǎng)基成分及培養(yǎng)條件等也會(huì)影響PEA的合成［3］。分離及純化方法和步驟的微小差異對(duì)PEA的純度和收率可能產(chǎn)生較大影響，工業(yè)化生產(chǎn)的分離純化方法因考慮到生產(chǎn)規(guī)模、操作的方便程度以及生產(chǎn)成本等諸多因素也會(huì)與實(shí)驗(yàn)室方法有所不同。

1.2.1PEA的培養(yǎng)方法P.V.Liu首先發(fā)現(xiàn)PA－103為綠膿桿菌外毒素高產(chǎn)菌株，并認(rèn)為它是不產(chǎn)生蛋白酶或很少產(chǎn)生蛋白酶的菌株，此后被公認(rèn)為PEA標(biāo)準(zhǔn)生產(chǎn)株。P.V.Liu經(jīng)實(shí)驗(yàn)研究報(bào)道了提取PEA的培養(yǎng)方法，即利用胰蛋白酶大豆肉湯透析液作培養(yǎng)基，經(jīng)培養(yǎng)、離心，取其上清液即為粗毒素。第三軍醫(yī)大學(xué)的學(xué)者用胰酶酪蛋白大豆肉湯培養(yǎng)基(Trypticsoybroth，TSB)，還有學(xué)者用TSA甘油培養(yǎng)基振蕩培養(yǎng)綠膿桿菌PA103株，經(jīng)流水透析、離心，取其上清液制成粗毒素［4］。有報(bào)道稱，鐵離子對(duì)綠膿桿菌的生長(zhǎng)起到一定的促進(jìn)作用，而對(duì)其代謝過程中產(chǎn)生PEA卻有一定的抑制作用［5］。因此，有學(xué)者采用細(xì)菌生長(zhǎng)培養(yǎng)基中加入鐵離子，經(jīng)離心洗滌2次后轉(zhuǎn)換到去除鐵離子的產(chǎn)毒培養(yǎng)基中繼續(xù)培養(yǎng)，從而解決綠膿桿菌生長(zhǎng)需鐵而PEA產(chǎn)生受鐵抑制的矛盾，使PEA產(chǎn)量大幅度提高。軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院微生物流行病研究所梁小兵等為了提高PEA的產(chǎn)量，采用了兩代種子活化法［6］。在生長(zhǎng)培養(yǎng)基中加入葡萄糖成分促進(jìn)綠膿桿菌生長(zhǎng)，在產(chǎn)毒培養(yǎng)基中加大甘油含量從而增加PEA的生成，同時(shí)在產(chǎn)毒培養(yǎng)基中加入少量NTA防止PEA的迅速降解，保證產(chǎn)毒水平不低于國(guó)外報(bào)道水平，培育時(shí)間比國(guó)外學(xué)者報(bào)告的18h縮短4～6h。

1.2.2PEA的分離、純化和鑒定P.V.Liu通過在粗毒素中加入醋酸、加入飽和硫酸銨、DEAE纖維素柱層析、SephadexG－200柱層析等步驟得到純化PEA;Callahan提出將粗毒素經(jīng)薄膜超濾法濃縮，再經(jīng)羥基磷灰石吸附層析、DEAE纖維素離子交換層析、葡聚糖G－150凝膠過濾層析等四步純化法精制了毒素;劉小明等用DE－52纖維素階段洗脫、硫酸銨分級(jí)沉淀、SephadexG－25除鹽、DE－52纖維素梯度洗脫、SephadexG－200分子篩層析等四步純化了PEA［7］，劉啟富等用70%飽和硫酸銨沉淀SephadexG－100柱層析，DE－52柱層析，羥基磷灰石柱層析制備PEA［4］。之后有學(xué)者提出用聚丙烯酰胺凝膠電泳法純化毒素。但規(guī)模生產(chǎn)所用的毒素純化方法還需將DEAE纖維素吸附、飽和硫酸銨沉淀、梯度洗脫、羥基磷灰石柱層析等步驟結(jié)合起來才能得到較高收率的純PEA。PEA的鑒定通常采用十二烷基硫酸鈉聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS－PAGE)方法。在SDS－PAGE電泳圖譜上，PEA提取物呈現(xiàn)一條主要帶，相對(duì)分子質(zhì)量為66MD。同時(shí)用PEA抗血清作免疫印跡分析，得到的抗原性和分子量結(jié)果均與文獻(xiàn)報(bào)道一致，即可證實(shí)純化的蛋白為PEA。

2PEA重組毒素的研究進(jìn)展

免疫毒素由具有導(dǎo)向能力的“載體”和具有細(xì)胞毒性的“彈頭”以一定的連接方式偶聯(lián)而成。因其兼有抗體的特異性和毒素的細(xì)胞毒作用，所以能夠通過載體準(zhǔn)確找到靶細(xì)胞，用其攜帶的具有細(xì)胞殺傷能力的毒素定向攻擊腫瘤細(xì)胞，而對(duì)正常組織不產(chǎn)生殺傷作用，因此被形象地稱作“生物導(dǎo)彈”。

2.1對(duì)抗體的研究單鏈抗體蛋白的分子量很小(25kD)，使其很容易穿過血管組織和致密的腫瘤屏障，進(jìn)入實(shí)體瘤周圍的微循環(huán)。將單鏈抗體與毒素基因重組，由具有導(dǎo)向作用的抗體將毒素?cái)y帶并導(dǎo)入靶細(xì)胞，對(duì)靶細(xì)胞進(jìn)行特異性殺傷。單鏈抗體與腫瘤抗原的結(jié)合有極強(qiáng)的特異性，并具有較低的免疫原性，而且單鏈抗體免疫毒素生產(chǎn)工藝簡(jiǎn)單，易于大量生產(chǎn)，是臨床治療腫瘤的理想藥物。但是許多抗原抗體的結(jié)合作用都與結(jié)合部位相關(guān)，從而限制了單價(jià)單鏈抗體的應(yīng)用。為了將單鏈抗體更好地應(yīng)用于臨床，可引入亮氨酸拉鏈、半胱氨酸及α－螺旋等結(jié)構(gòu)，將單價(jià)單鏈抗體加以改造，構(gòu)建成雙價(jià)單鏈抗體分子(dsFv)。dsFv不僅穩(wěn)定性更強(qiáng)，還具有與單價(jià)單鏈抗體相同的特異性和很強(qiáng)的殺傷細(xì)胞毒素活性。另有學(xué)者為了降低抗體的鼠源性，增強(qiáng)其親和性，將具有較強(qiáng)特異性和親和力的鼠類抗原加以改造，制成具有完整抗體結(jié)構(gòu)的人－鼠工程抗體，應(yīng)用于臨床將是更加實(shí)際有效的方法，也是重組毒素抗體研究的發(fā)展方向。

2.2對(duì)毒素的研究生物導(dǎo)彈(重組毒素)常用的彈頭(毒素)有兩類:一類是植物毒素，包括苦瓜毒素(MD)、篦麻籽毒素(RT)、相思子毒素(abrin)等。另一類是細(xì)胞毒素，包括白喉毒素(DT)、綠膿桿菌外毒素(PE)。綠膿桿菌外毒素A因其極強(qiáng)的細(xì)胞毒性通常被用作重組毒素的“彈頭”部分，其毒性本質(zhì)是它能夠催化真核細(xì)胞延伸因子－2的ADP核糖基化，阻止肽鏈延長(zhǎng)中斷細(xì)胞蛋白質(zhì)合成而行使細(xì)胞毒作用。重組免疫毒素常用的綠膿桿菌外毒素是PE40，它是將PE分子去除Ⅰa區(qū)產(chǎn)生的。將PE40和特異性抗體相連接制成重組毒素，對(duì)受體細(xì)胞具有強(qiáng)烈殺傷性。但此類免疫毒素有實(shí)體瘤穿透率低，體內(nèi)半衰期短的弊端，并且免疫毒素本身具有一定的毒副作用。因此，學(xué)者們應(yīng)用基因工程手段通過改造PE分子結(jié)構(gòu)來改善重組毒素的性狀。目前應(yīng)用于重組毒素的綠膿桿菌外毒素的突變體有PE38、PE38KDEL、PE35等幾種［8］。這些衍生物雖然減少了非特異結(jié)合，但仍會(huì)對(duì)正常細(xì)胞和組織造成傷害。一些免疫毒素由于半衰期較短，會(huì)嚴(yán)重?fù)p害血管內(nèi)皮細(xì)胞，造成血管滲漏綜合癥(VascularLeakSyndrome)。目前，已有學(xué)者對(duì)重組毒素蛋白的質(zhì)控方法和質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行了研究，為重組蛋白的批量生產(chǎn)和臨床應(yīng)用奠定了基礎(chǔ)。史新昌等采用結(jié)晶紫比色法和反相高效液相色潛法(RP－HPLC)分別測(cè)定GP38蛋白的生物學(xué)活性和純度，建立人性腺激素釋放激素類似物－PEA功能片段重組蛋白GP38的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)和質(zhì)控方法，不僅可用于GP38蛋白產(chǎn)品的常規(guī)檢定，還可為其他重組蛋白的檢定提供理論依據(jù)［9］。

2.3存在的問題及前景展望重組免疫毒素的特異性較高，細(xì)胞毒活性較強(qiáng)，用于靶向治療腫瘤不僅療效好，而且副作用低，是一種前景廣闊的癌癥治療藥物。但其存在體內(nèi)半衰期較短，血管滲漏綜合征出現(xiàn)率高，免疫原性較高的弊端，而且目前所用的單克隆抗體多為鼠源性，人體使用后會(huì)產(chǎn)生抗鼠源單克隆抗體的抗體，這些因素都限制了免疫毒素的反復(fù)應(yīng)用。重組毒素免疫原性高的根源在于其分子量較大，一般都在35kD以上，所以尋找小型毒肽替代PE40已經(jīng)成為一種必然。用基因工程的方法，對(duì)抗體和毒素進(jìn)行改造，使鼠源抗體人源化并弱化毒素免疫原性，是完善和發(fā)展重組毒素導(dǎo)向治療的研究方向，可使免疫毒素成為攻克癌癥頑疾的首選藥物。一種新型基因工程免疫毒素是將毒素基因接入表達(dá)質(zhì)粒，通過堿性的魚精蛋白將質(zhì)粒與scFv相互連接，scFv將質(zhì)粒引導(dǎo)至靶細(xì)胞，通過預(yù)先設(shè)計(jì)可使毒素在胞內(nèi)的表達(dá)受控于可誘導(dǎo)的或靶細(xì)胞特異性啟動(dòng)子。這種基因工程抗體可以有效彌補(bǔ)抗原的相對(duì)特異性不足，使毒素更有選擇性地到達(dá)靶細(xì)胞。一種新型的胞內(nèi)抗體以mRNA形式由逆轉(zhuǎn)錄病毒、腺病毒等載體送達(dá)到靶細(xì)胞，翻譯成抗體，使某些腫瘤細(xì)胞基因蛋白失活。這種新型抗體免疫原性大大降低，可作為載體廣泛應(yīng)用于重組毒素。劉綺明等經(jīng)過研究獲得了PEA常用肽上各氨基酸殘基與抗原性的相對(duì)關(guān)系數(shù)據(jù);通過對(duì)PEA常用肽上的6個(gè)關(guān)鍵區(qū)域分別置換1～2個(gè)氨基酸的方法，顯著降低了PEA的抗原性，為構(gòu)建安全有效的免疫毒素的奠定了基礎(chǔ)。

3綠膿桿菌疫苗的研究進(jìn)展

3.1傳統(tǒng)綠膿桿菌疫苗的研究傳統(tǒng)的細(xì)菌疫苗多注重在刺激宿主產(chǎn)生抗體，以對(duì)抗病原菌或加強(qiáng)巨噬細(xì)胞的噬菌能力，進(jìn)而阻止細(xì)菌在患者體內(nèi)繁衍。

3.1.1內(nèi)毒素蛋白多價(jià)疫苗敬德仲等從我國(guó)11個(gè)血清型和美國(guó)Fisher7個(gè)血清型綠膿桿菌菌株中提取內(nèi)毒素蛋白，篩選出攻擊耐受性最強(qiáng)的三種血清型的綠膿桿菌內(nèi)毒素蛋白制成三價(jià)疫苗，綠膿菌素免疫耐受力為4～500LD50。經(jīng)北京、天津、重慶、黑龍江等32家醫(yī)院400余例臨床療效觀察，治療綠膿桿菌感染總有效率達(dá)83.7%。

3．1.2超免疫血漿的研究超免疫血漿用于綠膿桿菌易感者的預(yù)防和綠膿桿菌感染的治療，如燒傷、創(chuàng)傷、手術(shù)后以及呼吸道、尿路等綠膿桿菌感染的預(yù)防及治療。20世紀(jì)80年代，黑龍江省科學(xué)院微生物研究所與上海亞太輸血中心、瑞金醫(yī)院協(xié)作研制了人用綠膿桿菌超免疫血漿。經(jīng)47例嚴(yán)重?zé)齻颊吲R床實(shí)驗(yàn)(治療組26例，應(yīng)用綠膿桿菌超免疫血漿;對(duì)照組21例，用常規(guī)治療。)結(jié)果治療組有1例死于綠膿桿菌感染(3.8%)，而對(duì)照組8例死于綠膿桿菌感染(38.1%)。衛(wèi)生部成都生物制品研究所與中國(guó)人民第三軍醫(yī)大學(xué)研制的抗綠膿桿菌凍干免疫血漿經(jīng)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)和臨床使用，證明不僅對(duì)同群菌株攻擊有良好的保護(hù)作用，而且對(duì)異群菌株攻擊也有較好的保護(hù)作用。經(jīng)臨床應(yīng)用于嚴(yán)重?zé)齻颊哂行蕿?1.5%，應(yīng)用于呼吸道感染病人有效率為90%。目前，凍干綠膿桿菌超免疫血漿的市場(chǎng)需求越來越大，有專門信息咨詢機(jī)構(gòu)定期對(duì)凍干抗綠膿桿菌人血漿行業(yè)的整體及其相關(guān)子行業(yè)的運(yùn)行情況進(jìn)行調(diào)研，并對(duì)其未來的發(fā)展趨勢(shì)和前景進(jìn)行分析和預(yù)測(cè)［10］。作為治療綠膿桿菌感染的輔助制劑，抗綠膿桿菌凍干免疫血漿因其能有效對(duì)抗耐藥菌株而得到更多專家學(xué)者的關(guān)注。

3.1.3脂多糖疫苗的研究綠膿桿菌脂多糖疫苗是由6個(gè)血清型菌株提取的脂多糖組成的聯(lián)合疫苗，它可剌激機(jī)體產(chǎn)生體液抗體，增強(qiáng)嗜中性白細(xì)胞的吞噬功能。應(yīng)用于231例綠膿桿菌感染癥患者的臨床治療證明，這種疫苗對(duì)燒傷感染、中耳炎等綠膿菌感染病癥的治療總有效率達(dá)90%以上，對(duì)我國(guó)綠膿桿菌11個(gè)血清型標(biāo)準(zhǔn)株有較好的保護(hù)作用。該疫苗不僅安全性高、而且毒性和副作用小，是我國(guó)治療綠膿桿菌感染癥的一種新藥［11，12］。

3.2綠膿桿菌多聯(lián)疫苗的研究綠膿桿菌感染宿主的途徑多種多樣，產(chǎn)生的臨床癥狀也各不相同，而綠膿桿菌在繁殖過程中所產(chǎn)生的多種有毒代謝產(chǎn)物，對(duì)各種臨床癥狀也有不同程度的影響，尤其是綠膿桿菌的主要致病因子—外毒素A對(duì)機(jī)體的傷害最大。傳統(tǒng)的幾種綠膿桿菌疫苗因其抗體種類單一而不能有效預(yù)防和治療綠膿桿菌外毒素A對(duì)機(jī)體造成的病害，無法對(duì)患者提供足夠的保護(hù)作用。近年來，有學(xué)者嘗試研究了一種包含了綠膿桿菌外毒素A、外膜蛋白、彈性蛋白和堿性蛋白所制備的類毒素等多成分的綠膿桿菌多聯(lián)疫苗。此疫苗無毒性且抗原性穩(wěn)定，在水貂和人類體內(nèi)的初步測(cè)試，證實(shí)可以刺激宿主細(xì)胞產(chǎn)生抗體，中和綠膿桿菌產(chǎn)生的多種有毒代謝產(chǎn)物，而且可以增強(qiáng)巨噬細(xì)胞的吞噬功能。但這種多成分的疫苗不但制造麻煩，而且很難控制每種成分的比例、含量，在接種疫苗后，免疫的效果差異也很大。

3.3基因工程疫苗的研究綠膿桿菌外毒素A是綠膿桿菌致病的最重要的內(nèi)在機(jī)制，嚴(yán)重感染綠膿桿菌但能夠存活下來的患者，其體內(nèi)的抗綠膿桿菌外毒素A抗體的濃度都很高;因感染而死亡的患者，其體內(nèi)卻含有較低濃度的抗綠膿桿菌外毒素A抗體。此外，免疫力低下的患者可以通過使用抗綠膿桿菌外毒素A抗體使自己免受綠膿桿菌感染的威脅。但是綠膿桿菌外毒素A的毒性很強(qiáng)，如何利用基因工程方法降低或消除PEA的毒性，發(fā)展更安全、有效的綠膿桿菌疫苗，是科學(xué)家的研究重點(diǎn)之一。

3.3.1PEA毒性的消除方法以往消除PEA毒性都是用福爾馬林處理，使其蛋白變性，制成沒有毒性的類毒素。再用類毒素免疫家兔，產(chǎn)生免疫應(yīng)答后取兔血，血清即為抗PEA抗體。這種減毒方法仍有可能產(chǎn)生有害的毒素。因此就有科學(xué)家利用基因工程的技術(shù)讓綠膿桿菌外毒素A的毒性消失，但仍然保留大部分抗原性，而成為無毒性的綠膿桿菌外毒素A類毒素。利用這種類毒素，可以有效刺激機(jī)體產(chǎn)生抗體，中和綠膿桿菌外毒素A的毒害作用。這比先前用福爾馬林處理綠膿桿菌外毒素A制造類毒素疫苗的傳統(tǒng)方法更安全，而且抗原性也較強(qiáng)。

3.3.2重組融合蛋白疫苗利用基因工程技術(shù)消除綠膿桿菌外毒素A的毒性區(qū)域，用綠膿桿菌的多種外膜蛋白替代這一區(qū)域，形成一種多成分綠膿桿菌疫苗，即重組融合蛋白疫苗。動(dòng)物實(shí)驗(yàn)表明這種疫苗確實(shí)可以刺激宿主產(chǎn)生與細(xì)菌表面抗原結(jié)合的特異性抗體，并能夠促進(jìn)巨噬細(xì)胞的吞噬作用，還可以對(duì)抗外膜蛋白產(chǎn)生免疫力，能夠抵抗所有不同血清型的綠膿桿菌的感染，因此是一種更有效的新型綠膿桿菌疫苗。

3.3.3基因工程亞單位疫苗基因工程亞單位疫苗(Subunitvaccine)是利用DNA重組技術(shù)，將編碼病原微生物保護(hù)性抗原的基因?qū)胧荏w菌(如大腸桿菌)或細(xì)胞，并在受體中高效表達(dá)，分泌保護(hù)性抗原肽鏈。將保護(hù)性抗原肽鏈提取出來，加入佐劑即制成基因工程亞單位疫苗。它能克服一些常規(guī)疫苗的缺陷，代表了疫苗發(fā)展的一個(gè)新途徑［13］。

3.4PA－MSHA菌毛株疫苗綠膿桿菌－甘露糖敏感血凝(PA－MSHA)菌毛株疫苗常被稱作“綠膿桿菌制劑”，是一種能全面提高及調(diào)整癌癥患者的體液免疫和細(xì)胞免疫功能，增強(qiáng)抑制和殺傷癌細(xì)胞效應(yīng)的新型細(xì)菌性免疫調(diào)節(jié)劑(或稱PA－MSHA免疫調(diào)節(jié)劑)，是癌癥患者理想的輔助治療藥物。這種疫苗常被用作急性白血病、惡性淋巴瘤、肺癌的輔助治療藥物，在乳腺癌的治療上也取得了很好的療效［14，15］。此外，英國(guó)研制出一種用于治療綠膿桿菌感染的口服型疫苗。通過成人志愿者小人群臨床試驗(yàn)證明，口服接種免疫后，血清IgA水平提高并能促進(jìn)機(jī)體產(chǎn)生并增強(qiáng)吞噬綠膿桿菌的能力，口服適宜劑量的此疫苗在人體內(nèi)是安全的并且具有免疫原性。此疫苗還有望治療纖維囊腫病人，消除這些病人肺部寄生的綠膿桿菌，避免呼吸衰竭而導(dǎo)致的死亡。除了人用綠膿桿菌疫苗以外，還有學(xué)者對(duì)動(dòng)物綠膿桿菌感染性疾病進(jìn)行了發(fā)病情況和流行特點(diǎn)調(diào)查，研制了多種疫苗對(duì)抗綠膿桿菌的感染，其中以滅活菌苗為主。有學(xué)者利用綠膿菌外膜蛋白疫苗和基因工程疫苗有提供共同保護(hù)性抗原的優(yōu)點(diǎn)，將其應(yīng)用于預(yù)防水貂出血性肺炎上，取得了較好效果［16］。

4PEA的應(yīng)用綠膿桿菌外毒素A除了具有“與抗體結(jié)合制成免疫重組毒素用于靶向治療”以及“開發(fā)各種綠膿桿菌疫苗以預(yù)防和治療綠膿桿菌感染”的用途外，在食品中綠膿桿菌的鑒定、癌癥治療及作為抗原攜帶蛋白生產(chǎn)去勢(shì)疫苗等方面都有廣闊的應(yīng)用前景。

4.1在菌種鑒定和檢測(cè)方面的應(yīng)用目前綠膿桿菌菌種鑒定方法主要依據(jù)其生理生化特性用生物學(xué)方法實(shí)現(xiàn)，但該方法周期長(zhǎng)，步驟多且復(fù)雜，使其在食品衛(wèi)生領(lǐng)域綠膿菌的鑒定受到限制。北京農(nóng)學(xué)院的艾啟俊等應(yīng)用PCR技術(shù)研究設(shè)計(jì)了一種鑒定食品中綠膿桿菌感染的方法。他們根據(jù)編碼綠膿桿菌外毒素A基因設(shè)計(jì)引物，通過PCR方法擴(kuò)增出外毒素A基因［17］。此方法可從金黃色葡萄球菌、綠膿桿菌、乳酸菌、大腸桿菌菌液異性地檢出綠膿桿菌外毒素A基因。該方法操作簡(jiǎn)單、靈敏度高，可檢測(cè)到含量為3cfu/mL的綠膿桿菌，同時(shí)還有快速、特異性強(qiáng)等特點(diǎn)，也可用作臨床標(biāo)本細(xì)菌感染中綠膿桿菌的鑒定。山東農(nóng)業(yè)大學(xué)的高玲美等用過碘酸鈉法將過氧化物酶標(biāo)記抗PEA抗體(IgG)，制成酶標(biāo)抗體，通過平板凝集實(shí)驗(yàn)法和酶標(biāo)抗體ELISA法對(duì)照實(shí)驗(yàn)，對(duì)羊體內(nèi)抗PEA抗體含量進(jìn)行了檢測(cè)。結(jié)果證明，酶標(biāo)抗體ELISA法檢測(cè)的抗體效價(jià)要比平板凝集實(shí)驗(yàn)法平均高出2個(gè)滴度，表明制備的PEA酶標(biāo)抗體具有靈敏度高、特異性強(qiáng)的優(yōu)點(diǎn)［18］。這種技術(shù)已被開發(fā)制成人綠膿桿菌外毒素A(PEA)酶聯(lián)免疫試劑盒，并已廣泛應(yīng)用于樣品中綠膿桿菌外毒素A濃度的檢測(cè)。

4.2在動(dòng)物生育調(diào)控方面的應(yīng)用綠膿桿菌外毒素A是一種有效的抗原攜帶蛋白，藉由綠膿桿菌外毒素A能夠攜帶蛋白質(zhì)的特性，可將其應(yīng)用到除PEA以外的其它不同疫苗的研究上，以提升該抗原的免疫效果。例如利用重組DNA的方法，把去毒性的綠膿桿菌外毒素A作為攜帶蛋白與促性腺素釋放激素(Gonadotropin－releasinghormone，GnRH)接合，用細(xì)菌作為生產(chǎn)去勢(shì)疫苗的載體，免疫后的動(dòng)物都能夠產(chǎn)生很強(qiáng)的抗GnRH的抗體，抑制該動(dòng)物的性腺發(fā)育和生殖功能。與外科手術(shù)去勢(shì)的方法相比較，去勢(shì)疫苗不僅方便有效、簡(jiǎn)單易行，而且降低了對(duì)動(dòng)物機(jī)體的傷害和去勢(shì)成本，是一種具有發(fā)展前景的去勢(shì)手段。

4.3在癌癥治療上的應(yīng)用對(duì)于癌癥的治療，現(xiàn)行的放療和化療方法沒有特異性，對(duì)人體的傷害很大。而靶向重組毒素因其特異性強(qiáng)，副作用小，成為必然替代放療和化療方法治療癌癥的新型藥物。目前，利用重組毒素治療癌癥治療的研究已在國(guó)內(nèi)外專家的努力下取得了實(shí)質(zhì)性進(jìn)展，但大多數(shù)處于動(dòng)物實(shí)驗(yàn)階段，還沒有廣泛應(yīng)用于臨床。

4.3.1PEA細(xì)胞毒作用在癌癥治療上的應(yīng)用利用綠膿桿菌外毒素A極強(qiáng)的細(xì)胞毒作用，可將其用作靶向重組毒素的彈頭部分。張鴻等研究了促黃體激素釋放激素(LHBH)基因與綠膿桿菌外毒素A(PE40)基因重組蛋白(LHBH－PE40)對(duì)非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞A549的毒性作用，發(fā)現(xiàn)LHRH－PE40可以誘導(dǎo)A549細(xì)胞凋亡［19］。燕翔等通過實(shí)驗(yàn)研究得到基因重組轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子α－綠膿桿菌外毒素融合蛋白(TGFα－PE40，簡(jiǎn)稱TP40)對(duì)人膀胱癌細(xì)胞的生長(zhǎng)具有劑量、時(shí)間依賴性抑制作用的結(jié)論［20］。姜洋等經(jīng)研究發(fā)現(xiàn)重組人促黃體激素釋放激素－綠膿桿菌外毒素A(LHRH－PE40)對(duì)過度表達(dá)LHRH受體的胃癌均具有特異有效的抗腫瘤活性［21］。還有更多的學(xué)者利用基因工程技術(shù)合成了用于治療各種癌癥的重組毒素，如新型肝癌免疫毒素A54－PE40KDEL［22］，并通過動(dòng)物試驗(yàn)或體外試驗(yàn)證實(shí)具有毒殺癌細(xì)胞的作用。此外，有學(xué)者利用PEA細(xì)胞毒作用制成重組免疫毒素，用以治療其他疾病。李勝濤將與FcεRI高度結(jié)合的人IgE的Fc片段作為靶向部份與PEA偶聯(lián)，組成靶向免疫毒素，對(duì)肥大細(xì)胞有凋亡作用，用以治療過敏性疾?。?3］。

4.3.2PEA作為蛋白質(zhì)攜帶載體在癌癥治療上的應(yīng)用利用綠膿桿菌外毒素A能夠攜帶蛋白質(zhì)或DNA進(jìn)入細(xì)胞中的特殊功能，還可將其用作載體開發(fā)出極佳的基因治療工具或蛋白質(zhì)治療藥物。馬超等利用外毒素結(jié)構(gòu)域Ⅰa基因表達(dá)蛋白的佐劑效應(yīng)，構(gòu)建綠膿桿菌外毒素A與Ⅱ型單純皰疹病毒糖蛋白嵌合蛋白表達(dá)載體，經(jīng)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)證實(shí)，此嵌合表達(dá)蛋白可誘導(dǎo)產(chǎn)生抗HSV－2特異性抗體并具有較強(qiáng)的免疫原性［24］。劉艷華等應(yīng)用綠膿桿菌外毒素的結(jié)構(gòu)域Ⅱ(PEⅡ)的轉(zhuǎn)膜效應(yīng)，構(gòu)建了以Ⅰ型促性腺激素釋放激素(GnRHⅠ)為導(dǎo)向部分，以絲瓜毒素luffinS2為毒性部分的重組嵌合毒素GnRH－PEⅡ－luffinS，體外實(shí)驗(yàn)證實(shí)其對(duì)腫瘤細(xì)胞有顯著殺傷作用［25］。還有學(xué)者成功地構(gòu)建了毒性基因缺失的PEA與人組蛋白H4融合基因的原核表達(dá)載體，為進(jìn)一步表達(dá)并獲得大量的融合蛋白奠定了基礎(chǔ)［26］。

4.3.3PEA的超抗原特性在治療癌癥上的應(yīng)用PEA是由綠膿桿菌分泌的一種可溶性蛋白質(zhì)，可大量激活T淋巴細(xì)胞，屬外源性超抗原。超抗原對(duì)免疫系統(tǒng)的影響很大，無論是急性效應(yīng)(包括食物中毒和中毒性休克綜合征)還是長(zhǎng)期效應(yīng)(包括自身免疫性疾病和免疫缺陷)通常對(duì)機(jī)體都是有害的，但如果合理利用其“能迅速激活大量T淋巴細(xì)胞”的特性，超抗原可以增強(qiáng)機(jī)體的免疫反應(yīng)，對(duì)機(jī)體產(chǎn)生積極的作用。利用PEA的這一特性，學(xué)者們將其應(yīng)用于腫瘤治療中可獲得明顯的療效。PEA超抗原通過大量激活細(xì)胞毒性T淋巴細(xì)胞(CTL)與NK細(xì)胞，使得這兩種細(xì)胞參與的免疫細(xì)胞介導(dǎo)的殺腫瘤細(xì)胞活性相應(yīng)增強(qiáng)。此外，被激活的大量T淋巴細(xì)胞會(huì)分泌一種具有抗增殖作用的IFN2γ，也促進(jìn)了這種抗腫瘤活性的增強(qiáng)。重組毒素除了應(yīng)用在抗腫瘤、治療自身免疫性疾病等方面，還在其他疾病的治療或預(yù)防上發(fā)揮作用。有學(xué)者將甲型流感病毒M2蛋白胞外區(qū)與銅綠假單胞菌外毒素A相融合，并構(gòu)建融合蛋白的原核表達(dá)載體，免疫小鼠后再用流感病毒A/PR/34/8株攻擊小鼠。經(jīng)檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，這種方法能夠抑制病毒在肺內(nèi)的復(fù)制。此項(xiàng)研究為甲型流感病毒廣譜疫苗的進(jìn)一步研發(fā)打下了基礎(chǔ)［27］。

篇(7)

雖然血源性乙肝疫苗在控制乙肝方面發(fā)揮了重要作用，但它并非十全十美，應(yīng)用之初，就顯露了其本身的一些缺點(diǎn)。其一，來源有限，無法大規(guī)模穩(wěn)定生產(chǎn)；其二，在HBsAg 陽性血漿采集、運(yùn)輸和加工過程中，有可能造成環(huán)境污染及乙肝病病毒傳播；其三，盡管疫苗生產(chǎn)過程中采用三步滅活工藝，應(yīng)用后至今未發(fā)展1人因注射疫苗而發(fā)病，但極難確保所有潛在性致病因子（特別是未知的致病因子）均被滅活；其四，生產(chǎn)中需要較高的純化抗原技術(shù)及滅活要求，成本較高，并影響疫苗的免疫原性。有鑒于此，并影響疫苗的免疫原性。有鑒于此，血源性乙肝疫苗只能作為一種過度性疫苗，尚需開發(fā)新型疫苗。

70年代末期，在乙肝病毒的基因序列已基本弄清的基礎(chǔ)上，不少國(guó)家開始研究基因工程疫苗。1986年，美國(guó)一家公司用酵母表達(dá)的HBsAg基因工程疫苗投產(chǎn)。此后，重組細(xì)胞疫苗、多肽疫苗等。也相繼問世。上述疫苗的制備不需要合適的血漿，也不需要采取針對(duì)致病因子的滅活措施，因而可以高效穩(wěn)定地大規(guī)模工業(yè)化生產(chǎn)，且安全性更高，價(jià)格較便宜。從實(shí)際接種的效果看，基因工程疫苗的保護(hù)率與血源性疫苗相同，其抗體陽轉(zhuǎn)率在95%以上，母嬰傳播阻斷率在85%以上，能夠顯著降低乙肝病毒的感染率和攜帶率，且無嚴(yán)重不良反應(yīng)，是安全而有效的免疫制劑。

與此同時(shí)，國(guó)內(nèi)外對(duì)乙肝疫苗的接種方法進(jìn)行了大量研究，目前各國(guó)的接種方案就是根據(jù)這些研究成果制定的。1991年我國(guó)頌布了乙肝免疫方案：

1. 接種對(duì)象：

對(duì)乙肝的深入研究證實(shí)，感染乙肝病毒的年齡越小，成為慢性持續(xù)性感染的可能性越大。如果在1歲以內(nèi)感染，將導(dǎo)致70-90%的嬰兒成為乙肝病毒攜帶者；如果在2-3歲感染，將有40-70%的兒童成為攜帶者；如果在4-6歲時(shí)感染，有10-40%的兒童成為攜帶者；如果在7歲以上感染，只有6-10%變成攜帶者。也就是說，新生兒時(shí)期預(yù)防乙肝效果最好。

因此，我國(guó)的乙肝免疫方案要求全體新生兒接種乙肝疫苗，在條件許可的情況下擴(kuò)大到學(xué)齡前兒童。

2. 免疫途徑：

乙肝疫苗的接種途徑包括肌肉、皮下和皮內(nèi)注射數(shù)種；肌肉注射又分上臂三角肌和臀部?jī)煞N。目前多采用肌肉注射方法，注射部位以上臂三角肌為宜。

3. 免疫程序與劑量：

我國(guó)的乙肝免疫方案規(guī)定，接種程序?yàn)?、1、6月三針間隔接種。"0"指新生兒出生后24小時(shí)內(nèi)的第一針，對(duì)其他兒童或成年人則為第一針起始時(shí)間；"1"為間隔1個(gè)月接種第三針；"6"指第一針后的6個(gè)月接種第三針。應(yīng)當(dāng)強(qiáng)調(diào)，三針疫苗必須按時(shí)注射，特別是第一針一定要及時(shí)注射，應(yīng)用越早，效果越好；第二針如果因故未能按規(guī)定時(shí)間注射，略晚幾天也可以，但不得超過8周；第三針為加強(qiáng)免疫，也應(yīng)按時(shí)接種，因故提前1個(gè)月或延后1-2個(gè)月亦可，但最遲不能超過10個(gè)月。

4.加強(qiáng)接種問題：